新冠样本核酸提取及检测效果评价
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新冠样本核酸提取及检测效果评价

时间:2022-01-01 12:15:36 点击:109 次 来源:洛阳典润科技有限公司 官网

目的 对7种新型冠状病毒核酸检测试剂盒以及5种核酸提取方法进行比较分析。


方法 选取44例新型冠状病毒阳性临床样本,核酸提取后利用7种新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行RT-PCR扩增实验,比较不同试剂盒的阳性率及Ct值;选取33例新型冠状病毒阳性临床样本,利用5种核酸提取方法对样本进行提取,后对提取的核酸进行RT-PCR扩增实验,比较不同试剂盒的阳性率及Ct值。


结果 核酸提取试剂盒中品牌A的阳性率,漏检率;核酸提取方法比较显示,手工过柱法提取的核酸阳性率,其次为磁珠法,一步法检测的漏检率。


结论 目前新型冠状病毒检测试剂盒的检测能力参差不齐,在选用之前需做好评价工作。核酸提取方法中,手工过柱法提取效果好但耗时较长;磁珠法由于能配套核酸自动提取仪使用,故提取效率高,适合大批量样本的提取工作;一步法虽步骤简便,但漏检率高,不建议临床使用。


本文通过对市面上7种不同的核酸检测试剂盒以及5种核酸提取方法进行比较分析,综合评判不同检测试剂盒以及不同核酸提取方法对核酸检测结果的影响,为医院检验科、核酸检测机构等对核酸检测试剂盒以及核酸提取方法的选择提供参考依据。


1 材料与方法


1. 1 试剂与仪器

LabServ预分装病毒总核酸提取试剂盒(96×2规格,批号:B21T001),美国Fisher Scientific公司;磁珠法核酸提取试剂盒(品牌A、B);一步法核酸释放剂(品牌C);手工过柱提取试剂盒(品牌D、E);新型冠状病毒核酸双靶标检测试剂盒(品牌A、B、C);新型冠状病毒核酸单靶标检测试剂盒(品牌D、E、F、G)。


Thermo Scientific KingFisher Flex核酸自动提取仪,美国Thermo Fisher公司;SLAN96P实时荧光定量PCR仪,湖南圣湘生物科技有限公司。



1. 2 样本来源


核酸检测试剂盒比较:武汉火神山医院COVID-19确诊病例样本44份(42份鼻咽拭子标本和2份痰液样本)。


核酸提取方法比较:武汉火神山医院COVID-19确诊病例阳性样本33份(31份鼻咽拭子标本和2份痰液样本)。


以上样本已在前期临床检测筛查中确定为双靶标基因(ORF1ab和N)阳性,选择样本时,依据前期检测的循环阈值(cycle threshold,Ct)结果,按强阳、中阳和弱阳分类选择。使用前保存于-80℃冰箱。


1. 3 病毒核酸提取


核酸检测试剂盒比较分析:参照LabServ核酸自动提取试剂说明书进行操作准备,后利用核酸自动提取仪依照相应程序对核酸进行提取。


核酸提取方法比较分析:参照不同品牌核酸提取品牌试剂盒相应的说明书进行核酸提取(表1)。由于一步法核酸扩增是利用样本释放剂直接将样本中的核酸进行释放,所以本研究将此法归为核酸提取方法中的一种进行分析。磁珠法利用核酸自动提取仪进行核酸提取。


表1 本研究中使用的5个品牌核酸提取试剂基本情况比较



1. 4 实时荧光RT-PCR检测


核酸检测试剂盒比较分析:利用LabServ核酸自动提取试剂对44份病例样本进行核酸提取后,利用同一批核酸,使用市面上7种新冠病毒核酸检测试剂盒进行实时荧光RT-PCR,体系与反应条件均依据相应说明书进行配置(表2)。


表2 本研究中使用的7个品牌核酸检测试剂基本情况比较



核酸提取方法比较:使用新冠病毒核酸检测试剂盒比较分析实验中扩增效果的试剂盒,依据相应说明书进行反应条件配置,对不同方法提取的核酸进行实时荧光RT-PCR,从而比较不同核酸提取方法的提取效果。


由于核酸放置过久或反复冻融可能降解,导致实验数据出现误差,本实验在核酸提取完成后立即将模板加入配置好的扩增体系中,同时置于多台PCR仪进行核酸扩增。


1. 5 统计学分析


采用SPSS 23.0软件对数据进行统计处理,组间差异检验方法为单因素方差分析,多重比较检验方法为LSD法;P<0.05表示差异具有显著统计学意义。


2 结果


2. 1 新型冠状病毒核酸检测试剂盒比较分析


2. 1. 1 阳性率比较分析 


对44例前期检测为双阳性的样本,利用双靶标(ORF1ab和N基因)的3种检测试剂盒检测结果进行比较分析显示(表3),品牌A的试剂盒检测效果较好,仅有5份样本检测为单阳,其余39份的检测结果均为双阳;品牌B的结果则出现了2例检测为单阳,5例检测为阴性,其余37例样本检测结果为双阳;品牌C的结果显示有6例单阳和5例阴性结果。通过具体分析显示,品牌B和C中检测结果为单阳和阴性的样本均为品牌A中Ct值较低的样本,说明该两种品牌对低核酸浓度样本的检测敏感性不够好。


表3 44例样本双靶标检测试剂盒检测结果比较分析



通过对44例样本单靶标(均为ORF1ab基因)检测试剂盒阳性数量比较分析(表4),品牌D~G共4种试剂盒的阴性样本数量依次为5、6、7、11,其余样本检查均判定为阳性,说明由品牌D~G的试剂盒对新冠病毒的检测能力依次下降。


表4 44例样本单靶标检测试剂盒检测结果比较分析



2. 1. 2 敏感性比较分析


为进一步比较不同试剂盒对相同样本扩增的敏感性,分别对核酸检测试剂盒扩增ORF1ab和N基因的Ct值进行了统计分析。由于品牌G试剂盒的扩增条件与其他试剂盒不同(存在预扩增步骤),所以其Ct值且明显低于其他品牌,并未加入敏感性高低的比较分析。结果显示,扩增ORF1ab基因的敏感性由高至低的排序为品牌F>B>E>D>A>C(表5);扩增N基因的敏感性由高至低的排序为品牌B>A>C(表6)。


以上结果说明,品牌A试剂盒在Ct值的敏感度方面虽表现并不是的,但其检测的阴性数量为0,其余品牌均发生了不同程度的漏检,而且品牌C及G的漏检率更高(表3,表4)。


表5 6 个品牌核酸检测试剂盒检测44例样本核酸中ORF1ab 基因的Ct 值比较



注:同一列组间字母不同代表差异显著,6个品牌的Ct值差异具有统计学意义(F=26.672;P<0.05);x±s,n=44


表6 6 个品牌核酸检测试剂盒检测44例样本核酸中N基因的Ct 值比较



注:同一列组间字母不同代表差异显著,3个品牌的Ct值差异具有统计学意义(F=5.594;P<0.05);x±s,n=44


2. 2 新型冠状病毒样本核酸提取方法比较分析


2. 2. 1 阳性率比较分析


通过对33例前期检测为双阳性的鼻咽拭子或痰液样本利用不同方法进行核酸提取后的核酸检测结果进行分析(表7),阳性结果比较显示,利用手工提取方法(品牌D和品牌E)所提取的核酸检测的阳性数量,均为31份;利用磁珠法提取的两种方法中,品牌A和品牌B所提取的核酸检测的阳性数量分别为30份和23份,其中品牌B的结果显示,该法出现了6例样本的漏检,结果显示为假阴性;利用一步法直接进行核酸扩增的品牌C结果显示,仅有20例样本检测为阳性,出现假阴性的样本数量高达10份,说明该法存在较高的漏检率。


表7 33例样本利用不同品牌核酸提取试剂盒提取后核酸检测结果比较分析



2. 2. 2 敏感性比较分析


检测结果的Ct值侧面反映核酸提取后的模板中核酸的浓度。统计结果分析显示,2种手工提取方法所提取出的核酸浓度相差不大且相比其他方法浓度更高,其次为磁珠提取法的品牌A,而磁珠提取方法的品牌B和一步法扩增的品牌C结果相差不大,且相比其他方法敏感度较低(表8、表9)。


以上结果说明,手工过柱的提取方法提取效果相差不大,且漏检率较低;磁珠法的2个品牌原理虽相同,但品牌A提取出核酸的阳性率要明显高于品牌B;而一步法的品牌C的敏感性较低,而且漏检率。


表8 利用5品牌核酸提取试剂盒提取33例样本核酸后检测核酸中ORF1ab 基因的Ct 值比较



注:同一列组间字母不同代表差异显著,5个品牌的Ct值差异具有统计学意义(F=3.233;P<0.05);x±s,n=33


表9 利用5品牌核酸提取试剂盒提取33例样本核酸后检测核酸中N基因的Ct 值比较



3讨论


本研究通过对数十例新冠病毒实际样本的核酸提取与检测,比较了不同检测试剂盒以及不同核酸提取方法的实际效果,以往的研究一般仅凭借经验或少数样本量进行评价比较[6-7],目前不同检测机构所使用的核酸检测与提取试剂品牌和方法也多有不同,对于国内外品牌及不同提取方法之间的比较,目前并无实际数据报道,而本研究得出的实际数据,可为新冠病毒检测方法的比较提供参考。此外,本研究虽并未指出所比较试剂的品牌,但通过对不同试剂盒检测体系以及条件的设置等方面的比较,可为检测机构对于核酸检测相关试剂的选用提供参考依据。


结合本研究小组在新冠病毒检测工作中遇到的实际问题,现就新冠病毒核酸提取及检测方面的一些探索讨论如下。


3. 1 核酸检测试剂盒的选择


对于医院检验科及检测机构来说,采用何种核酸提取方法和核酸检测试剂盒是影响新冠病毒检出率的重要因素。对核酸检测试剂盒的评价,虽然Ct值的高低从侧面反映了试剂盒的敏感度,但是该值的高低与试剂盒的扩增体系和条件等均有较大关系,所以不能仅通过评价指标来评定试剂盒的好坏,还应结合检测的阳性率等指标,综合选择漏检率低的,尤其是对低浓度的核酸具有较高扩增能力的试剂盒,这样能有效降低漏检的概率。如品牌A扩增试剂盒的Ct值结果虽不如其他品牌,但其检测的阳性率却是的,从体系的比较中可见,品牌A的体系中加入的模板量多为20 μl,而品牌B、D、E、F加入的模板量为10~15 μl,均发生了不同程度的漏检,品牌C及G所加入的模板量相对较低,分别为5和2.5 μl,所以该两个品牌发生单阳或阴性的概率较大,更易导致漏检的发生。因此体系中模板量的高低是影响阳性率重要因素之一,加入模板量高的体系对于低浓度的样本具有较好的检测效果。


当然,不同检测试剂盒中酶、染料的质量或探针的序列与质量、不同化合物的配比浓度等都能影响检测的准确度和灵敏度,但作为试剂盒的使用方,并不能获得产品较为详细的信息,仅能在严格遵照试剂盒说明书的基础上,比较其终的扩增检测结果来对进行评价。而且目前仅对试剂盒的敏感性进行了比较分析,关于特异性,由于火神山医院为针对新冠病毒肺炎的专科医院,受条件所限不能加入其余常见病原的检测,所以并未对这几种核酸检测试剂盒的特异性进行比较分析。


此外,关于单靶标与多靶标检测试剂盒的选用,多靶标试剂盒能同时检测新冠病毒的2~3个靶点,但该种试剂盒对仪器要求稍高,同时试剂价格相比单靶标的更高;而单靶标的试剂盒由于价格低、对仪器要求低,所以更适合对大批量样本的初筛。


3. 2 核酸提取方法的选择


本研究发现手工过柱提取的方法漏检率较低,而且敏感性比其他方法更高,但该方法耗时较长,尤其样本量大时,频繁的离心过柱使得时间成本大大增加,所以并不用于大批量样本的筛查;而磁珠法由于能配合使用自动核酸提取仪,所以能有效节约时间和人工成本,非常适合对大批量样本的核酸提取,但本研究中所使用的两种磁珠提取方法,进口试剂的提取效果明显高于国产试剂,这提示国内的生产商要不断提高产品质量与技术含量,从而降低国内检测机构对国外试剂的依赖性。对于一步检测法来说,由于该法仅仅将10 μl的样本加入至反应体系中,降低了病毒在反应体系中的存在概率。由于该法漏检率高且敏感度较低,所以并不使用。


3. 3 核酸检测假阴性的原因


从疫情发生之初至今,已有多例疑似患者是经由核酸检测2~3次才呈现阳性结果,而且部分患者甚至已出现了明显症状,但核酸检测仍然多次为阴性;还有的出院患者发生“复阳现象”[8],即在连续2次核酸检测结果为阴性后出院,但出院后复查核酸结果却为阳性,目前虽还不能确定复阳发生的真实原因,但不能排除是在住院期间的核酸检测出现假阴性从而导致漏检。



核酸检测发生假阴性的原因是多方面的,主要包括以下几点:①临床采样:已有研究虽指出新冠病毒在下呼吸道的病毒载量较高,检出率更高[5],但目前采样量的仍然是鼻、咽拭子,病毒在上呼吸道的病毒载量变化仍然不明确,而且采样手法也是影响采样效果的重要因素,采样部位是否深入,或由于有些患者会在采样中发生明显的咳嗽、喷嚏等应激反应,面临风险有可能会导致采样人员采样不彻底,造成假阴性的检测结果[9]。②样本运输:由于新冠病毒是RNA病毒,极易降解,所以此类样本应置于样本保存液中于冷藏状态下运输,并且在尽短的时间内检测,否则一些低浓度的样本很易由于降解而导致假阴性。③检测相关试剂:疫情初期为了缓解由于检测试剂不足而导致无法确诊的问题,国家开辟“绿色通道”在很短的时间内即批准了多家品牌的试剂上市,正常情况下,病毒核酸检测试剂的上市需要临床、质控等多个环节的验证才能批准,所以紧急上市不可避免地会出现一些质量上的问题,或一些未知因素而导致检测的假阴性,在前期检测工作中发现,某品牌一步法检测试剂盒的核酸释放液由于和某品牌的样本采样液发生未知的相互反应,导致检测结果全部为阴性。④RT-PCR技术特性:由于RT-PCR技术的高度敏感性,所以也不能排除由于病毒发生基因突变而导致检测失败。


3. 4 核酸检测备选方案的重要性


对于核酸检测实验室来说,除了应常规注意的样本污染之外,频繁的核酸检测会形成大量核酸气溶胶,很易造成PCR产物污染,甚至在检测样本量达到一定程度后,PCR扩增室会大量存在扩增产物,一旦由于实验员疏忽或一些其他原因就会将扩增产物带入核酸提取间或体系配置间而造成扩增体系污染,加上RT-PCR技术及其敏感,故极易造成大批量的检测结果出现假阳性的情况,并且污染产物降解缓慢,不易处置,这样就给核酸检测工作增大了困难。在与多家检测机构的交流中发现,随着检测任务的加大,很易出现对新冠病毒N基因检测的假阳性。所以,建议检测机构在检测任务开始之前即准备2~3种不同扩增引物探针的检测试剂盒,从而在发生一种扩增产物污染的情况下,马上选用备选试剂盒进行扩增,避免陷入PCR产物污染后无计可施的窘境。

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